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近日，40001百老汇官网电子游戏的合作单位湖北省疾病预防控制中心在《Frontiers in Microbiology》杂志上发表了题为“Genetic characterization of human adenoviruses in patients using metagenomic next-generation sequencing in Hubei, China, from 2018 to 2019”的研究成果。该研究基于40001百老汇官网电子游戏GenoLab M高通量基因测序平台与Illumina的NextSeq 550高通量基因测序平台，对湖北省某儿童医院25例上呼吸道感染患者的鼻咽拭子样本进行mNGS测序。基于测序的分析结果，探讨了病原基因组组装的准确性，以及两个平台在病原微生物mNGS检测方面的一致性，随后，对完整组装的HAdVs基因组特征进行了全方位的剖析，为中国HAdVs流行病学调查及公共卫生安全提供新的见解。
*以下为该研究成果解读
腺病毒（Human adenoviruses，HAdVs) 是人呼吸道感染常见的病原体之一，可引起广泛的临床疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等，在儿童及免疫功能缺陷患者中症状尤其严重。HAdVs基因型别众多，且不同型别间或同一型别内均可发生重组，导致新的毒株产生，对公共卫生安全产生极大的影响。传统对HAdVs的诊断及分型主要依赖病毒分离培养、血清学及关键衣壳蛋白（capsid）基因的PCR鉴定，费时费力，且对中和抗体等试剂依赖程度很高。基于mNGS的病原微生物诊断，可以直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，而不依赖微生物的分离和培养，能够快速、客观地检测临床样本中所有未知的病原微生物，已成为感染性疾病精准诊断的重要工具。此外，通过对mNGS序列进行病原体基因组组装，可以在基因组和基因层面对病原体进行深入的探究。
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研究框架
本研究于2018~2019年，在湖北省咸宁市某医院收集400例流感样上呼吸道感染患者的鼻咽拭子样本，对常见呼吸道病毒病原体进行筛查后，确定21例HAdVs阳性患者，共获得25份样本（包含4例病毒分离培养样本）。随后，将这25个样本分别使用GenoLab M及NextSeq 550平台进行宏基因组测序和相关分析。
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mNGS组装完整性及准确性评估
本研究首先对所有下机数据进行测序质量评估，确定GenoLab M及NextSeq 550平台均可获得可靠的mNGS测序数据。随后对测序reads进行de novo组装，并评估了组装的完整度及准确性。结果表明：①在组装完整性方面（指标：contig数量, N50, N90, 最大contig长度，覆盖度），两平台基本一致；②在组装准确性方面（指标：组装的基因组与参考基因组的比对率），GenoLab M平台88% (22/25)的样本，NextSeq 550平台84% (21/25)的样本，获得了＞90%的比对率。说明两平台组装的基因组准确性均较高，可以进行后续基因组特征的分析。
Table1 GenoLab M与NextSeq 550组装参数表
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平台间mNGS物种注释结果比较
研究人员对两个平台的mNGS数据进行了物种注释，发现检出的微生物种类及丰度高度一致，且HAdVs含量丰富。临床样本相对病毒分离培养的样本，检出的微生物种类更为复杂。SE75（图1B）模拟测序与SE150（图1A）测序获得一致的物种注释结果，说明在基于mNGS的HAdVs感染诊断中，测序时间更短的SE75模式同样适用，可以实现更快速的病原体诊断。
图1 mNGS物种注释结果比较
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HAdVs基因型分类及进化树分析
该研究对25个测序样本进行了HAdVs分型，共鉴定得到7种HAdVs基因型：HAdV-B3 (n=9)，B7 (n=1)，B55 (n=2)；HAdV-C1 (n=2)，C2 (n=6)，C5 (n=1)；以及HAdV-E4 (n=4)。结果表明，在湖北咸宁地区，HAdV基因型多样性较高，且以B3, C2和E4为主。不同的基因型聚类为不同的进化分支，同一基因型的不同分离株聚类为同一分支。
图2 HAdVs基因型分类及进化树分析
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不同基因型的全基因组进化树分析
为进一步探讨不同型别的分离株与已发现的参考毒株的进化关系，研究人员对HAdV-B，C，E毒株分别进行了全基因组进化分析。结果表明：①新鉴定的分离株与对应的参考毒株形成预期的聚类，且与当地广泛流传的毒株进化关系密切；②B3基因型已开始形成新的聚类分支，需加强流行病学监测；③S64、S71和S28分离株经重组及全基因组比对分析，确定为重组毒株。
图3 不同基因型全基因组进化树分析
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核苷酸一致性和多样性分析
全基因组核苷酸一致性分析表明，HAdVs不同型别间具有较高的进化保守性，HAdV-B, C和E基因组一致性分别达到93.52%，97.49%和96.99%。三个关键capsid基因——penton，hexon和fiber的多样性分析表明：penton基因在HAdV-C中更为保守，在HAdV-B中多样性很高，且存在两个明显的高变区；hexon基因在HAdV-B和C中多样性更高，同样存在两个高变区，形成中和抗体识别的表位；fiber基因在三种基因型中，多样性都很高，其C端的γ表位参与血凝抑制，决定病毒的组织偏好性（嗜性）。
图4 病毒全基因组及关键capsid基因核苷酸一致性及多样性分析
基于上述分析，我们得出如下结论：
1、mNGS可以应用于临床样本HAdVs的快速诊断；
2、通过de novo组装可以得到完整的病毒基因组，其准确性及完整度满足后续基因层面的分析要求；
3、新鉴定的HAdV-B3分离株形成明显的新聚类，且与北京株亲缘关系密切，提示区域传播的可能；
4、本次检测到3个HAdV重组病毒株，属于HAdV-B55及HAdV-C2基因型；
5、Capsid基因存在高核苷酸多样性和高频的重组事件，提示在中国进行HAdV流行病学监测的必要性。